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引言

该研究开发了一种刺激触发的药物传递载体，利用生物相容性的蜡石纳米管作为载体，实现了选择性抗癌药物传递到人体细胞。

通过物理吸附的糊精端盖，成功实现了荧光素在细胞间的释放。纳米管穿过细胞膜，其摄取效率与细胞的生长速率相关。

细胞内的糖苷水解酶催化糊精管端盖的分解，触发内部荧光素的释放，对人体肺癌细胞（А549）具有更好的消除效果，相比肝癌细胞（Hep3b）。糊精包覆的蜡石纳米管酶活化的细胞内传递系统为抗癌治疗提供了有前景的平台。

一 、纳米纳药物传递系统的设计与应用

1.1纳米载体设计

纳米载体是一种纳米尺度的药物传递系统，具有可调节的大小、形状、孔隙性和表面性质。它们可以用于将药物直接靶向传递到生物细胞内。

目前有多种类型的纳米载体被研究和应用，包括脂质体和胶束系统、聚合物结合物、多孔硅胶、磁性纳米颗粒、氧化石墨烯纳米片、超分子容器和介孔碳纳米球等。

这些载体可以通过受控释放的方式，在细胞膜上实现纳米药物转运，从而实现药物的靶向输送。

为了实现药物的靶向输送和控制释放，纳米载体通常需要额外的响应性表面涂层。这些涂层可以通过外部因素（如激光照射）或内部因素（如细胞内pH梯度）来触发纳米载体内药物的释放。

常见的方法是在药物载荷的纳米颗粒上涂覆响应性涂层，如pH响应性硅烷层，以限制药物在细胞外的释放。通过激光照射或光解反应，药物可以在细胞内释放。

然而，使用外部触发器的方法不适用于内部器官的治疗，而pH触发的释放需要合成聚合物，并可能导致增加的毒性。

除了外部和内部触发器，基于细胞内酶激活的药物释放系统被认为是一个有前景的替代方案。

就像碳氢化合物可以共价键合到硅烷上，用于控制糖苷水解酶触发的药物释放。这种系统可以使抗癌药物从介孔硅胶纳米颗粒中释放，并在体外对癌细胞产生有效作用。

蜡石纳米管是一种有前景的多功能纳米载体。它们具有稳定的分散性，可以选择性地装载带电药物分子或进行表面修饰。

蜡石纳米管具有良好的生物相容性，并可以长时间保存装载后的药物。通过聚合物涂层，药物的释放速率可以延长到几天甚至几周。

1.2刺激响应性药物释放

这项研究使用生物相容性的50纳米直径蜡石纳米管作为药物传递载体，实现了对人体细胞的选择性抗癌药物传递。

研究中使用物理吸附的糊精端盖来确保荧光素药物在细胞间的释放。药物载荷的纳米管能够穿过细胞膜，其摄取效率取决于细胞的生长速率。

在细胞内，糖苷水解酶介导下，糊精管端盖被分解，从而触发内部荧光素的释放，对人体肺癌细胞（A549）具有更好的消除效果，相比于 （Hep3b）。

该研究显示了使用糊精包覆的蜡石纳米管进行酶活化的荧光素细胞内传递的前景作为一种抗癌治疗平台。

这项研究表明，纳米载体设计对于实现药物的靶向传递至细胞内是至关重要的。纳米载体，如蜡石纳米管，在药物传递领域具有广阔的应用前景。

通过选择合适的载体类型、响应性涂层和药物包装策略，可以实现对药物的控制释放和靶向治疗。

这项研究所采用的纳米管药物传递系统是一种刺激响应性的设计，利用糊精作为触发因子，实现药物的内部释放。这种方法可以提高药物的局部浓度，增强治疗效果，并减少对正常细胞的不良影响。

1.3蜡石纳米管作为药物传递系统

蜡石纳米管被提出作为一种多功能纳米载体，具有有效载药和表面修饰的成熟技术。蜡石是一种管状的铝硅酸盐粘土，具有50-60纳米的外径、12-15纳米的内径和约1微米的长度。

蜡石纳米管的SiO2表面呈负电性，Al2O3内腔表面呈正电性，因此可以选择性地装载带电药物分子或与纳米颗粒进行修饰。

蜡石纳米管在水中形成稳定的分散体，具有良好的生物相容性，并可将各种药物从浓缩溶液或熔体中装载到管内。

在研究中，通过将模型抗癌药物绿色荧光素（BG）装载到蜡石纳米管中，并用可被细胞间的糖苷水解酶水解的糊精（DX）包覆，开发了一种新型的药物传递系统。

蜡石纳米管通过被人体癌细胞有效摄取，进而通过细胞内糖苷水解酶对糊精涂层的水解，促使药物从纳米管中释放，并抑制细胞内的 功能。

该药物传递系统的设计需要具备生物相容性、有效的药物封装能力，并且刺激响应性涂层应受到细胞内因子的调控，最好是酶。

蜡石纳米管作为跨膜载体，利用两种生物相容化合物——绿色荧光素作为细胞毒物质，糊精作为酶活化的管口封堵剂。这种系统可以实现针对癌细胞的靶向传递，并通过细胞内的糖苷水解酶触发药物释放，从而干扰细胞的线粒体功能。

二 、实验

2.1试剂

超纯水是使用Millipore MilliQ逆渗透系统获得的。右旋糖，亮绿（BG），6-4,二胺基-2-苯基吲哚（DAPI），吖啶橙，溴化乙锭，重磺酸钠盐均从Sigma-Aldrich购买，除非另有说明。基于Applied Minerals Inc（美国）购买的蒙脱石纳米管（HNTs）。

2.2细胞培养

A549-人肺癌上皮细胞；Hep3b-肝细胞癌细胞从美国细胞培养物集合（ATCC，马里兰州洛克维尔，美国）获得。细胞在37℃和5％CO2的湿润气氛中孵育。

细胞在L-谷氨酰胺补充的Dulbecco改良的最小Eagle培养基（DMEM）中培养，其中包含100 U mL-1的青霉素，100 μg mL-1的链霉素和10%的胎牛血清（PAA实验室）。

通常，当细胞接近85-90％密度时，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液孵育5分钟，然后以1:10的比例分割。

制备以BG负载的HNTs并用右旋糖封口

在用BG负载之前，HNTs经乙醇洗涤两次，然后用无菌水洗涤并使用超声波浴分散30。通过在100 mg洗涤的HNTs中添加1 ml 1％BG溶液和60％水乙醇，开始负载，并在超声波处理30 s。

然后，装有HNTs和BG的瓶子放置在真空干燥器中1小时，以确保BG被吸入HNTs腔中。然后，为去除游离的BG，悬浮液用无菌水洗涤两次并离心。最后，将负载了BG的HNTs在45℃下干燥并研磨成细粉。

使用相同的HNTs样品在水中测量了BG负载的效率，控制样品（不含BG）用于评估洗涤过程中HNTs的流失。将10 mg BG负载的HNTs与1 mL水性右旋糖溶液（10 mg mL-1）混合，并超声波处理10 s。

然后，装有纳米管和右旋糖的瓶子放置在真空干燥器中1小时，随后用无菌水洗涤以去除未结合的右旋糖。在所有阶段，使用Malvern Zetasizer Nano ZS仪器监测水中HNTs的Zeta电位，使用标准U形槽。

2.3 HNTs的电子显微镜成像

使用Carl Zeiss Libra仪器获得了纯HNTs和BG负载HNTs的TEM图像。在覆有formvar的铜网格（Agar）上滴加稀释的HNTs悬浮液，然后使其蒸发，然后在120 V的加速电压下对HNTs进行成像。

使用Auriga（Carl Zeiss）仪器获得了纯HNTs和右旋糖包被HNTs（DX-HNTs）的SEM图像。样品使用Au（60％）和Pd（40％）合金在Q150R（Quorum Technologies）仪器上喷涂，使用3×10-4 Pa工作压力和10 kV加速电压，在InLens检测模式下进行成像。

2.4 DX-HNTs的细胞摄取

将105个细胞分别加入12孔培养板的每个孔中。然后将25、50或100 μg的DX-HNTs加入孔中。孵育24小时后，使用DIC对比显微镜（Carl Zeiss Axio Observer倒置显微镜（德国）使用ZEN软件操作）分析板，以评估细胞的密集生长。

增强暗场显微镜成像（EDF） 使用EDF显微镜观察DX-HNTs在细胞中的分布。将细胞生长在玻璃盖玻片上，并使用DAPI（1 μg mL-1）染色5分钟。然后用冷乙酸酯（-20℃）固定细胞，并嵌入安装介质中。

使用带有荧光物质的CytoViva®增强暗场准直器和荧光物质的奥林巴斯BX51直立显微镜进行EDF显微镜图像获取。使用CytoViva®双模荧光系统（紫外激发）可在DAPI核染色中可视化人细胞中的DX-HNTs。

2.5透射电子显微镜

使用JEOL 1200 EX显微镜（工作电压80 kV）获得了细胞和DX-HNTs的薄切片的TEM图像。将细胞固定在2.5%戊二醛中，使用一系列乙醇溶液逐渐脱水，使用Epon树脂嵌入，然后使用带有金刚石刀片的LKB超微切割机切割薄切片，并安装在铜网格上。使用2%水杨酸铀和柠檬酸铅对薄切片的细胞进行染色。

使用Dimension Icon显微镜，和Scan Asyst Peak Force Tapping（在空气中）模式，研究了细胞内的DX-HNTs分布。细胞生长在玻璃盖玻片上，固定，用水洗去盐和碎屑，脱水并在空气中成像。使用Scan Asyst在空气中的探针（尖端半径-2 nm，弹簧常数-0.4 n m-1）（Bruker）进行成像。使用Nanoscope Analysis软件，处理获得的AFM图像。

2.6通过存活性染色进行细胞存活性研究

使用荧光显微镜评估使用AO/EtBr染料染色的存活和坏死细胞的比例。AO与细胞的DNA和RNA结合（绿色荧光），而EtBr只渗入坏死（死亡）细胞的细胞核（红色“死亡”荧光）。

将经过DX-HNTs处理的细胞分别接种到96孔板中（每孔104个细胞），孵育24小时。然后，在每个孔中加入10 μl的AO/EtBr（分别为1%和0.5%）溶液，孵育5分钟，然后用DPBS洗涤两次并进行成像。

用预热的DPBS洗涤覆盖玻片上的细胞单层，并使用4%戊二醛溶液在DPBS中固定10分钟。然后，用DPBS洗涤细胞两次，将0.2%Triton X-100（PBS）溶液加入孔中，并在室温下孵育15分钟以渗透细胞膜。

使用Alexa Fluor 568偶联的phalloidin进行F-actin染色（1:200稀释，孵育1小时）。然后用DPBS洗涤细胞三次，覆盖玻片并使用蒙脱石背景剂进行封面。在Leica TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜上进行图像获取。

三 、结语

这项研究开发了一种刺激响应的药物传递系统，利用生物相容性的蜡石纳米管作为载体，实现了对人体细胞的选择性抗癌药物传递。研究中使用物理吸附的糊精端盖来确保药物在细胞间的释放。纳米管能够穿过细胞膜，其摄取效率取决于细胞的生长速率。在细胞内，糖苷水解酶催化糊精管端盖的分解，从而触发内部药物的释放。研究结果表明，这种蜡石纳米管酶活化的细胞内传递系统对人体肺癌细胞具有更好的消除效果，相比于肝癌细胞。

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